李 峰1，吕锡武1，严 伟2
（1.东南大学 环境工程系，江苏 南京 210096；2.加拿大康柯迪亚大学） 摘要：以聚乙烯醇为包埋剂，探索其制备固定化细胞小球的工艺过程，着重从小球颗粒的机械强度、传质性能及微生物活性等三个方面来选择其最适宜的包埋条件。最后，还对固定化细胞的保存进行了试验研究。
关键词：聚乙烯醇； 固定化细胞； 包埋剂； 废水处理
中图分类号：X703.5
文献标识码：A
文章编号：1000-4602(2000)12-0014-04 Study on Polyvinyl Alcohol (P V A) as Entrapping Agents for Immobilizing Microbial Cell
LI Feng1,LU Xi-wu1,YAN Wei2
(1.Depart.of Environ. Eng., Southeast Univ., Nanjing 210096,China;
2.Depart.ofMech.Eng.,ConcordiaUniv.,Montreal,Quebec,Canada,H3G1M8) Abstract： In this paper, the preparation of immobilized cells ware explored by choosing P V A as entrapping agents. The optimal conditions were chosen in terms of the mechanical stability, mass transfer, and bacteria activity of the cells. In addition, experiments on the preservation of the immobilized cells were done.
Keywords： polyvinyl alcohol (PVA); immobilized cells; entrapping agents; wastewater treatment 固定化细胞技术是60年代初发展起来的生物工程新技术，在废水处理领域中具有处理效率高、装置占地小、剩余污泥产量少等优点，从而成为近年来研究的热点。目前细胞固定化方法［1］有载体结合法、交联法和包埋法三种。在各种固定化方法中，尤其以利用高聚物在形成凝胶的过程中将微生物固定在其内部的包埋法优点更为突出。在包埋法固定化技术中，首先是选择合适的包埋剂及包埋条件。适用于废水处理的包埋剂应满足：在固定化过程中，微生物活性丧失少；固定成球后，机械强度高，传质性能好，性质稳定等。包埋剂主要有琼脂、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、明胶、几丁质及聚乙烯醇(简称PVA)等。针对废水处理的实际情况，一般认为PVA是比较合适的包埋剂，但对其作为包埋剂形成固定化细胞的性能及适宜包埋条件的研究还不够细致深入。针对上述情况，采用聚乙烯醇作为包埋剂，研究其包埋菌种的最适宜操作条件(包埋菌种取自锁金村污水处理厂曝气池活性污泥)。
影响固定化细胞制备的因素很多，主要有包埋剂、包泥量、交联剂、交联时间及小球粒径等。由于固定化细胞应用于废水处理中，需一定的强度及传质性能(如受曝气及机械搅拌的影响)，因此本试验先考察包埋剂中其他添加剂、交联剂对固定化细胞成球难易以及强度、传质性能的影响，获得固定化细胞制备的基本技术参数，然后以固定化细胞的CODCr去除率为主要指标，强度为辅助指标，采用正交试验确定其适宜的包埋条件。 1 材料与方法 1.1 试剂
聚乙烯醇PVA(平均聚合度1750±50)、硼酸(分析纯)、氯化钙(分析纯)、海藻酸钠(化学纯)、碳酸钠(化学纯)、氯化钙(化学纯)。
1.2 试验方法
① 固定化细胞的制备。固定化细胞的制备流程见图1。 
② CODCr去除效率的测定。在300mL人工合成的葡萄糖废水中，投入包埋了与活性污泥法同等泥量(2g)的固定化微生物小球，静态曝气24h后测定CODCr值，与活性污泥法做比较。
③ 强度试验。将固定化小球放入100mL注射器中，加一定的压力，观察小球的破损情况；或用手捏包埋好的固定化小球，以此来定性描述小球的强度。
④ 固定化小球传质性能的测定。取数粒固定化小球投入盛有200mL自来水的锥形瓶中，滴加两滴亚甲兰液，定时观察亚甲兰进入各种粒径小球的情况，以此为指标定性判断固定化小球的传质性能。 2 结果与讨论 2.1 固定化细胞制备的基本技术参数
据文献［2］报道，PVA—硼酸法包埋微生物形成的细胞小球受添加剂及交联剂的影响较大，因此，选用海藻酸钠作为添加剂，交联剂则采用2%的CaCl2及Na2CO3，并分别进行了包埋试验研究，试验结果见表1。 表1 添加剂和交联剂的影响| 试验编号 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# | 6# | | 包埋剂 | 10%PVA | 10%PVA | 10%PVA | 10%PVA | 10%PVA | 10%PVA | | 添加剂 | 无 | 1%海藻酸钠 | 2%海藻酸钠 | 2%海藻酸钠 | 0.5%海藻酸钠 | 0.2%海藻酸钠 | | 包泥量 | 1∶1 | 1∶1 | 1∶1 | 1∶1 | 1∶1 | 1∶1 | | 交联剂 | 饱和硼酸 | 饱和硼酸 | 饱和硼酸 | 饱和硼酸滴加
2 % CaCl2、Na2CO3调pH=6.7 | 饱和硼酸滴加
2%CaCl2、Na2CO3调pH=6.7 | 饱和硼酸滴加
2%CaCl2、Na2CO3调
pH=6.7 | | 平均粒径 | 约3 mm | 约3 mm | 约3 mm | 约3 mm | 约3 mm | 约3 mm | | 小球强度 | 较弱 | 一般 | 较强 | 强 | 强 | 强 | | 传质性能 | 一般 | 一般 | 较好 | 好 | 好 | 好 | | 成球难易 | 一般 | 易 | 易 | 易 | 易 | 易 | 在PVA—硼酸法包埋微生物中投加少量海藻酸钠，不仅容易成球，还可防止粘连现象；交联剂中采用2%CaCl2和Na2CO3调pH至6.7，进行硬化处理，可使小球强度得到提高。从表1可发现，3#试验小球的强度、传质性能均属上乘，但通过对3#小球进行静态曝气试验，发现小球结构极不稳定，经过1d的连续曝气后，添加剂海藻酸钠发生析出，小球结构松散，并容易解体。于是，逐步减少海藻酸钠的投加量，到6#试验的海藻酸钠投加量为0.2%时，基本没有析出现象，并能维持较好的强度和传质性能。因此，选用6#试验条件作为固定化细胞的基本包埋条件。
2.2 固定化细胞最适宜包埋条件的选择
在上述试验的基础上，采用正交试验［3］确定最佳包埋条件，设计四因素三水平正交试验表，各因素各水平的选择是在参考有关研究［2、4、5］的基础上拟定的。试验因素有：包埋剂浓度(A)、浓缩污泥与包埋剂溶液的重量比(简称包泥量B， W/V)、交联时间(C)及小球粒径(D)，以固定化细胞的CODCr去除率为主要指标，强度为辅助指标。各因素因子水平取值见表2，各因子水平组合设计见表3，试验结果见表4。 表2 正交试验各因素因子水平的取值| 包埋剂 | 因子水平 | 因子 | | A(%) | B(W/V) | C(h) | D(mm) | | PVA | 1 | 7.5 | 1∶1 | 16 | 7 | | 2 | 10 | 2∶1 | 24 | 5 | | 3 | 12.5 | 1∶2 | 32 | 3 | 表3 正交试验各因子水平组合设计| 因子代号 | 因子 | | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | | A | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | | B | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 | | C | 1 | 2 | 3 | 2 | 3 | 1 | 3 | 1 | 2 | | D | 1 | 2 | 3 | 2 | 1 | 2 | 2 | 3 | 1 | 表4 正交试验结果与分析| 序号 | 包埋剂浓 度(%) | 包泥量(W/V) | 交联时
间(h) | 小球粒径(mm) | 出水COD Cr(mg/L) | CODCr去除率(%) | | 1 | 7.5 | 1∶1 | 16 | 7 | 75.65 | 46.31 | | 2 | 7.5 | 2:1 | 24 | 5 | 62.18 | 55.87 | | 3 | 7.5 | 1∶2 | 32 | 3 | 76.68 | 45.58 | | 4 | 10 | 1∶1 | 24 | 3 | 55.14 | 60.87 | | 5 | 10 | 2∶1 | 32 | 7 | 76.34 | 45.82 | | 6 | 10 | 1∶2 | 16 | 5 | 79.17 | 43.81 | | 7 | 12.5 | 1∶1 | 32 | 5 | 73.24 | 48.02 | | 8 | 12.5 | 2∶1 | 16 | 3 | 81.25 | 42.33 | | 9 | 12.5 | 1∶2 | 24 | 7 | 69.43 | 50.72 | | K1 | 147.76 | 155.20 | 132.45 | 142.85 | | | | K2 | 150.50 | 144.02 | 167.46 | 147.70 | | | | K3 | 141.07 | 140.11 | 139.42 | 148.78 | | | | k1 | 49.25 | 51.73 | 44.15 | 47.62 | | | | k2 | 50.17 | 48.01 | 55.82 | 49.23 | | | | k3 | 47.02 | 46.70 | 46.47 | 49.59 | | | | R | 3.15 | 5.03 | 11.67 | 1.97 | | | 注 进水CODCr为140.9mg/L，同等泥量和同等操作
条件下未包埋菌出水CODCr为21.67mg/L，去除率为84.62%。 | 试验结果表明，在成球范围内，PVA浓度等三因子水平变化对强度影响不大。表4所列K值反映了对应因素在其他因素变化基本相同的条件下与CODCr去除率的关系，K值越大，说明在该试验条件下该因素的水平越好，而每个因素最佳水平的组合，即为CODCr去除率最高的试验条件。由表中数据可知，包埋剂PVA浓度为10%、包泥量为1∶1、包埋时间为24h、小球粒径为3mm是最佳工艺组合。这个计算结果刚好与4#试验的条件相同，试验证明，在该组合条件下，CODCr去除率达到了60.87%的最高水平。级差及大小反映了因素变化时试验的变化幅度，级差越大，就是该因素对指标影响越大，它就越重要。因此比较多因素的级差R，决定因素的主次关系为：  在这四因素中，交联时间对CODCr去除率影响最大，为主要因素，小球粒径影响较小，为次要因素，对次要因素常可根据实际情况选择其他水平。
2.3 固定化细胞的保存试验
尽管固定化细胞有诸多优点，但如果必须现场制作，则会给它的推广应用带来许多不利的影响。特别是对于某些特效降解菌，当出现事故(如原油泄漏)时，人们总是希望能直接投加固定化细胞而不需要进行长时间的驯化，因此就必须对固定化细胞进行适当的保存。试验设计使用了四种保存条件：A、干燥室温；B、冷藏(-4℃)；C、4℃合成废水(CODCr200mg/L左右，其他成分按生活污水配制)浸泡；D、4℃蒸馏水浸泡。按上述选定的包埋条件将锁金村污水处理厂曝气池活性污泥制成PVA小球，经10d保存后，取四种保存条件下小球各4g，在300mL合成葡萄糖废水中静态连续曝气，测定其CODCr降解变化。四种条件下CODCr去除率变化与曝气时间的关系见图2。 
经过保存和连续静态曝气后，各种保存条件下固定化细胞小球强度均有所降低，其中D(4℃蒸馏水浸泡)小球已解体。由图2可知，固定化细胞小球经一段时间(10d)保存后，活力均有所下降，但经过静态连续曝气又可使活性逐步恢复，其中C(4℃合成废水浸泡)小球活性恢复得最快，在曝气不到1d后即可达到原有水平，表明细菌存活率较高，主要原因是在低温条件下，即使细菌代谢活动极弱，也需要养料来维持生命活力，而A(干燥室温)、D(4℃蒸馏水浸泡)均不能满足这一要求，保存后活力大为下降；B(冷藏)则是在冷冻条件下，细菌处于休眠状态，存活率较高，但需要较长时间(＞1d)来使其恢复活性。经过静态连续曝气后，各种保存条件下固定化细胞小球的去除率均可得以恢复，有的已经超过保存前水平(冷藏和4 ℃合成废水浸泡)，表明包埋固定后暂时失活的细菌已驯化恢复活性或繁殖出更多高活性菌体，导致去除率提高。综上所述，四种保存条件中，以合成废水浸泡为最优，其次为冷藏(-4℃)、干燥室温和4℃蒸馏水浸泡。 3 结论 ① 聚乙烯醇(P V A)作为固定化细胞包埋剂的适宜包埋条件为：PVA浓度10%、包泥量1∶1、包埋时间24h、小球粒径3mm、投加2%的添加剂海藻酸钠，交联剂饱和硼酸用2%CaCl2和Na2CO3调pH至6.7进行硬化处理，包埋固定的小球具有较高的细菌活性，较好的强度及传质性能。
② 在选定的四因素的各个因子范围内，影响固定化细胞性能的主次关系依次为：交联时间、包泥量、PVA浓度、小球粒径。
③ 固定化细胞的四种保存条件中，优劣顺序依次为合成废水浸泡(4℃)、冷藏(-4℃)、室温干燥和蒸馏水浸泡(4℃)。 参考文献：
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［2］王磊.固定化硝化菌去除氨氮的研究［J］.环境科学，1997，18(2)：18.
［3］栾军.现代试验设计优化方法［M］.上海：上海交通大学出版社，1994.
［4］王蕾.固定化细胞厌氧—好氧工艺处理四环素结晶母液的试验研究［J］.环境科学，1995，16(1)：29.
［5］李彤.廉价包埋剂聚乙烯醇的研究［J］.环境科学，1990，11(5)：41.
作者简介：李峰(1974-)，男，江西玉山人，南京市市政设计研究院工程师，硕士，研究方向：水污染控制。
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收稿日期：2000-07-19 | 
