混合型微生物絮凝剂产生菌的最佳培养条件研究

李霞　 王向东　 林松　 宋若远
(四川大学建筑与环境学院，四川 成都，610065)

　　摘要：本文从活性污泥中筛选出了具有较高絮凝活性的混合菌MBFH，研究了各种条件对微生物产絮凝剂的影响。研究结果表明，混合菌MBFH产絮凝剂的最佳培养条件为：温度30℃、初始pH值8.0、摇床转速为120r／min、培养基含糖量为2％、相对接种量为15％，其对高岭土悬浊液的絮凝率可达到88％。
　　关键词：混合型絮凝剂产生菌　 正交试验　 培养条件　 生长曲线　

Study on optimum culture conditions of mixed flocculant－producing stain
Liaxia　 　Wangxiangdong　 　Linsong　　 Songruoyuan

　　Abstract: The mixed strains of MBFH which produced flocculating material was screened from activated sludge. In this paper, culture conditions for production of microbial flocculant were studied. The optimum culture conditions were found to be mixed microbial MBFH ,30℃, initial pH 8.0 , agitation rate 120rpm,the concentration of glucose 2%, relatively inoculums 15%,and the maximal fractional flocculation was about 88% in that conditions.
　　Key words: mixed flocculant-producing stain, culture conditions, growth curve, orthogonal test

　　微生物絮凝剂是利用生物技术,通过生物发酵、抽提、精制而得到的一种具有生物分解性和安全性的新型、高效、无毒的廉价的水处理剂[1]，因此具有逐步取代传统絮凝剂的趋势，并且应用的前景十分广泛。目前对其的研究已成为当今世界絮凝剂研究的主要课题，但是对微生物絮凝剂的研究依然存在较大的局限性，且人们重点研究的仍是单一菌种，由于微生物自身的特点使其菌体的生长受到很多因素的影响，致使其所产生的絮凝剂的絮凝效果同样受到很多条件的制约，而且由于微生物的培养成本较高使其在工业上的应用同样受到一定的限制。而混合菌种具有适应环境的能力强的优点，这样既可以提高菌种的生存能力又可以降低对其培养所需的成本。因此人们将微生物絮凝剂的研究方向投向既有生物降解能力又有絮凝能力的混合菌种[2]。本文从活性污泥中筛选出了絮凝效果较单一菌种好的混合菌种，通过研究确定了此混合型微生物絮凝剂产生菌合成絮凝剂的最佳培养条件，为其可以实现工业化生产提供依据。

1 材料及方法

1.1 菌种来源及培养基
　　菌种来源：污水处理厂二沉池的活性污泥
　　筛选培养基：葡萄糖10g，K2HPO4 　5g，MgSO4·7H2O 0.2g，尿素0.5g，KH2PO4 　2g，，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，水1000ml，pH值 7.5。
　　发酵培养基：葡萄糖20g，硫酸铵2g，KCl 0.5g，K2HPO4 　0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水 1000ml, pH值 7.0。
1.2 菌种分离与筛选
　　将活性污泥经筛选培养基富集培养后采用平板菌落稀释法[3] 得到单菌落，将其制成菌悬液后按10％的接种量接种于发酵培养基中，试验条件：温度30℃，摇床转速150r/min,pH值为7，发酵培养时间24小时。测定其发酵液的絮凝率，将筛选出的具有一定絮凝活性的菌株两两混合按1：1的比例接种于发酵培养基中进行发酵培养，以发酵液的絮凝率作为混合菌株筛选指标。
1.3 絮凝率的测定方法
　　于200ml烧杯中加入高岭土悬浊液（1g/l，静置90min后的上清液 ）93ml，1%CaCl2溶液5ml，发酵液2ml,用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液将pH值调至7.0左右。将其放置于磁力搅拌器上搅拌,快速搅拌1min,慢速搅拌2min,静置15min 后,吸收上清液于721型分光光度计550nm处测定其吸光度OD550,以高岭土悬浊液代替发酵液作对照,以絮凝率表示絮凝活性。絮凝率的计算公式为：

　　絮凝率(%) =(A-B)/A ×100%

　　式中　　A——对照样上清液550nm处的吸光度,
　　　　　　B——絮凝后上清液550nm处的吸光度。

1.4 生长曲线的测定
　　在500ml三角瓶内装200ml发酵培养基，温度30℃，初始pH为8，以120rpm摇床培养。定时取样测定其发酵液的pH值、菌体生长量（以浊度表示）及絮凝率。
1.5 培养条件优化试验
　　本实验采用正交试验方法，以絮凝率为控制指标，在30℃条件下考察初始pH、摇床转速、培养基含糖量及接种量等条件对混合型微生物絮凝剂产生菌的影响。
　　其试验安排选取L9（34）正交试验表[4]，因素水平见表1。

1.6 温度对混合型微生物絮凝剂产生菌的影响
　　在由正交试验所确定的最优产絮凝剂的培养条件下，将混合菌型微生物絮凝剂接种于装有100ml发酵液的250ml三角瓶中，分别在10℃、30℃、40℃下发酵培养，分别测定发酵培养12、24、36、48小时的絮凝活性。
1.7 混合型微生物絮凝剂产生菌的絮凝活性的分布
　　将发酵液以3000rpm离心30min，分别取上清液、菌体（用蒸馏水洗涤后悬浮与上清液等体积的蒸馏水中）和发酵液测定其絮凝率。以未离心的发酵液的絮凝率为100％。

2 结果与讨论

2.1筛选结果
　　本实验经反复多次筛选得到具有一定絮凝活性的微生物共19株，其中酵母3株，真菌3株和细菌13株，絮凝活性结果见表2。

　　将具有絮凝活性的13株细菌类絮凝剂产生菌进行两两混合培养，经过反复多次的筛选，筛选出了絮凝活性稳定且比单株菌活性高的混合型絮凝剂产生菌（絮凝效果见表3），并命名为MBFH。对该混合型絮凝剂产生菌进行形态观察可知，其中一株菌（菌名为X9）的菌落呈半透明状，周边圆滑，表面光滑湿润，粘性大。镜检时该菌呈杆状, 无芽孢，为革兰氏阳性菌，且在温度为37℃条件下培养能够快速生长。另一株菌（菌名为X21）的菌落表面较干燥、不光滑，粘性较小。镜检时该菌呈短杆状, 无芽孢，为革兰氏阳性菌，且在温度为37℃条件下培养生长缓慢。

2.2 MBFH的生长曲线
　　为了解混合菌的生长周期及其与絮凝率变化的关系，对混合菌MBFH的生长曲线进行测定。菌体生长量（OD660）、pH值和絮凝率的关系如图1所示。

　　由图1可知，在发酵培养过程中，混合菌MBFH在3小时后进入对数生长期，在16小时后到达稳定期，此时絮凝率达到最大（87％），在此之后缓慢下降并趋于稳定。这说明混合菌MBFH具有稳定的产絮凝剂能力，并且发酵液的絮凝率随菌体生长量的增加同步升高，这表明此混合型微生物絮凝剂的絮凝活性物质是由微生物在发酵过程中生物合成，而非微生物细胞自溶而产生，该结果与文献报道[3]的微生物产絮凝剂的结果相一致。同时由图1还可看出，发酵液初始pH随着菌体的生长而迅速下降，并于发酵培养15小时后pH降至4.30，随后趋于稳定。这是由于微生物对糖的吸收利用的过程中产酸，也可能是由于微生物絮凝剂本身是酸性的，随着絮凝剂的不断产生而使发酵液的pH值降低。
2.3 培养条件优化试验结果
2.3.1 MBFH培养条件优化正交试验结果分析
　　为了考察培养基的初始pH值、含糖量、摇床转速以及接种量对该絮凝剂产生菌的影响，确定其产絮凝剂的最佳条件。根据正交试验所设计的各种培养条件对MBFH混合菌进行培养（同时做两组平行），试验结果见表4。

　　从表4可以看出，培养基初始pH值变化对混合菌MBFH的絮凝活性的影响最大，混合菌MBFH在偏碱性环境条件下较适于絮凝物质产生。而培养基含糖量、摇床转速和相对接种量对絮凝活性影响作用较小。各因素对微生物絮凝剂的絮凝效果的影响程度大小的顺序为：培养基初始pH值>培养基含糖量>相对接种量>摇床转速。由以上四个因子水平对指标均值mi做直观分析见图2。由图可见，pH值为8、摇床转速为120r/min、培养基含糖量为2％、接种量为15％的絮凝率最高。因而絮凝剂产生菌的最佳培养条件是A₃B₁C₂D₃。此条件与正交试验中的产絮凝剂的最佳条件A3B2C1D3相比，摇床转速低，这样可降低絮凝剂合成的能源消耗。因此本试验将A₃B₁C₂D₃方案确定为最佳培养条件。

2.3.2 温度对MBFH产絮凝剂的影响
　　由正交条件所确定的最优产絮凝剂培养条件，分别在10℃、30℃、40℃下对混合菌MBFH进行发酵培养，测定其絮凝活性，其结果如图3所示。
　　由图3可见，温度对微生物积累絮凝剂有明显的影响。混合菌MBFH在30℃下的絮凝活性最高，在发酵培养12小时之后，絮凝率基本上稳定在80％左右。该混合菌在10℃、40℃下的絮凝活性仍较稳定，在10℃下在发酵培养24小时，絮凝率达到最大值(60％)；在40℃下在发酵培养15小时左右，絮凝活性达到最大值，絮凝率为53.09％。 因此，温度为30℃的发酵培养条件最适于混合菌MBFH产絮凝剂物质。发酵培养的温度过高或过低都会影响该混合菌产絮凝剂的能力，温度过高会使细胞组成成分蛋白质、核酸等发生变性，影响细胞的生长代谢，而温度过低则使反应速度降低，酶活性下降，代谢产物积累时间延长，不利于絮凝剂的产生。

2.4 MBFH的絮凝活性分布
　　根据絮凝活性分布试验结果（见图4）来看，混合菌MBFH絮凝活性约94.8％存在于上清液中，说明起絮凝作用的物质存在于发酵液中，是由菌体在发酵过程中产生并分泌到细胞外而成的；而菌体悬液的絮凝率出现负值，这是由于菌体悬液具有一定浊度，同时说明菌体细胞无絮凝效果，也说明菌体的存在干扰对高岭土悬液的絮凝效果。混合菌MBFH的发酵液经过4℃、35℃、60℃、80℃、100℃处理30min后测定其絮凝活性。结果发现（见图5），当热处理高达100℃时，絮凝活性下降至10％。由于某些以蛋白质为主要成分的微生物絮凝剂的活性受温度的影响较大，高温时变性，丧失部分絮凝能力[5]，而由多聚糖构成的絮凝剂则基本不受温度的影响[6]。因此推断该微生物絮凝剂包含一部分热不稳定物质，即蛋白质类物质和一部分热稳定物质，为多聚糖类物质。或者是由于加热造成线状分子的无规卷曲导致桥联作用的丧失，而电中和作用依然存在。

3 结论

　　（1）试验结果表明：从活性污泥中分离筛选出了混合菌MBFH。该混合菌的产絮凝剂的最佳培养条件为：温度 30℃、初始pH值8.0、摇床转速为120r／min、培养基含糖量为2％、相对接种量为15％；在此条件下，最大絮凝率约为88％。
　　（2）混合菌MBFH培养时间为16小时，在此时间内菌体生长量达到最大，且絮凝活性达到87％，其所合成的絮凝物质主要是由菌体在发酵过程中产生并分泌到细胞外而成的。
　　同时需要指出的是，此混合型微生物絮凝剂产生菌的菌种鉴定及其菌种的混合比例有待进一步的深入研究。

参考文献

1.郑怀礼.生物絮凝剂及絮凝技术.化学工业出版社，2004，1.
2.肖琳等主编.环境微生物实验技.中国环境科学出版社，2004，7.
3.Kurane R. Screening for characteristics of microbial flocculants[J] Agric Biol Chem,1986,50(9):2301-2307.
4.陆璇编著.数理统计基础.清华大学出版社，1998.
5.Ryuichiro Kurane. Culture condition for production of microbial flocculant by Rhodococcus erythropolis[J] Agric Biol Chem, 1986,50(9):2309-2313.
6.Hiroaki Takagi. Purfication and chemical properties of a flocculant produced by Paocilomyces Sp.[J] Agric Biol Chem, 1985,49(11):3159-3164.

作者简介：李霞，女，1979。现就读四川大学环境工程研究生，主要从事水污染控制方向。